Különbség a génklónozás és a PCR között | Gene Cloning vs PCR

Key Difference - Gene Cloning vs PCR

A DNS sok példányának DNS-fragmensből való szintézisét DNS-amplifikációnak nevezzük. Két fő DNS-amplifikációs folyamat van, nevezetesen gén klónozás és PCR. A génklónozás és a PCR között a legfontosabb különbség a génklónozás egy in vivo specifikus gén többszörözését eredményezi egy rekombináns DNS megalkotásával és egy gazda baktériumon belüli növekedésével, míg a PCR több millió példányt termel specifikus DNS-fragmentum in vitro ismételt denaturálási és szintézis-ciklusokon keresztül.

Tartalomjegyzék

1. Áttekintés és kulcskülönbség

2. Mi a Gene Cloning

3. Mi a PCR

4. Side by Side Összehasonlítás - Gene Cloning vs PCR

5. Összefoglaló

Mi a Gene-klónozás?

A génklónozás egy olyan módszer, amelyet egy szervezet specifikus génjének kinyerésére és szaporítására alkalmaznak a szervezet extrahált genomiális DNS-jéről a rekombináns DNS felépítése révén. A genomikus DNS több ezer különböző fehérjét kódoló gént tartalmaz. Amikor a DNS-t kivonják, magában foglalja az összes lehetséges gént. A gén-klónozási technika lehetővé tette egy specifikus gén kimutatását a teljes DNS-ből. Ezért a gén klónozás a molekuláris biológia egyik fontos eszköze.

A genomikus könyvtár létrehozása alapvető fontosságú a gén klónozásában, ha nem derül ki az adott gén DNS-ben való elhelyezkedését illetően. Egy genomi könyvtárat készítünk a következő lépések alkalmazásával.

1. lépés: A teljes DNS kinyerése egy olyan szervezetből, amely tartalmazza a kívánt gént.

2. lépés: Az extrahált DNS restrikciós emésztése kis kezelhető fragmensek előállításához. Ezt a lépést megkönnyíti a restrikciós endonukleázok.

3. lépés: Megfelelő vektor kiválasztása és a vektor DNS megnyitása ugyanazokkal a restrikciós endonukleázokkal. Bakteriális plazmidokat általában vektorokként alkalmaznak idegen DNS hordozására. A plazmidok a baktériumok körében elhelyezkedő DNS kisméretű körei.

4. lépés: A vektor-DNS és a fragmentált DNS kombinálása rekombináns DNS-molekula előállításához. Ezt a lépést a DNS-ligáz szabályozza.

5. lépés: Rekombináns DNS-molekulák gazdasejt-baktériumokba történő átvitele. Ezt a lépést transzformációnak nevezik, és hősokk alkalmazásával történik.

5. lépés: A transzformált baktériumsejtek vizsgálata táptalajon. A transzformációs folyamat végén transzformált és nem transzformált gazdasejtek kevert populációját kapjuk. A kérdéses génként csak a transzformált gazdasejtek tartoznak.Ezért szükséges transzformált sejtek kiválasztása. A szelekciót antibiotikumokat tartalmazó szelektív táptalajon végezzük. Csak a transzformált sejtek nőnek ezen a szűrőközegen, amely lehetővé teszi a kiválasztást.

6. lépés: A baktériumok növekedése génkönyvtár előállításához. Ebben a lépésben a transzformált gazdasejteket friss tápközegbe vezettük be, amely optimális növekedési követelményeket biztosít. A tenyésztő lemezeken lévő összes telepek képviselik a szervezet genomiális könyvtárát.

7. lépés: Az érdekes gént tartalmazó rekombináns DNS-molekulát át kell szűrni a rekombináns DNS több ezer klónozott fragmenséből. Ez elérhetõ olyan próbák alkalmazásával, amelyek a specifikus gént vagy a specifikus fehérjét a génbõl származtatják.

Ha a bakteriális kolóniát tartalmazó érdekelt gént azonosították a teljes telepekből, akkor lehetőség van arra, hogy több millió példányt készítsen a gént tartalmazó rekombináns plazmidról.

A génklónozást génkönyvtárak létrehozására használják, amelyek a szervezet speciális fehérjét, vitaminokat, antibiotikumokat, hormonokat, szekvenciákat és mapping genomokat állítanak elő, az egyének DNS-jének többszörös másolatát a törvényszéki ügyekben stb.

Figure_1: Gene Cloning

Mi a PCR?

A polimeráz-láncreakció (PCR) olyan technika, amely egy adott DNS-fragmens nagyszámú példányát generálja. Egy specifikus DNS-szekvencia exponenciális amplifikációját in vitro körülmények között PCR-rel állítjuk elő. Ez a technika nagyon hatékony eszköze a Molekuláris Biológia számára, mivel egy kis DNS mintát felhasználhat egy felhasználható mennyiségben. A PCR-t 1983-ban Kary Mullis vezette be, és ez a díjnyertes találmány óriási előrelépést hozott a molekuláris biológiában.

A PCR technika a 2. ábrán bemutatott ismételt PCR reakciókat követi. Az egyik PCR-reakció három fő lépésből áll, amelyek három különböző hőmérsékleten fordulnak elő; a kettős szálú DNS denaturálása 94 ° C-on ⁰ C, láncindítók lágyítása 68 ⁰ C és a szál megnyúlása 72 ⁰ C-nál. Ezért, amikor PCR-t hajtanak végre, a hőmérséklet-ingadozást nagymértékben meg kell tartani a megfelelő replikáció érdekében. A PCR-t a PCR-csövekben lévő PCR-készülékben végezzük. A PCR-csöveket helyes PCR-keverékkel töltöttük, amelyek templát DNS-t, Taq-polimerázt, primereket, dNTP-ket és puffert tartalmaztak. A kettős szálú DNS-DNS denaturálását egyszálú DNS-be úgy hajtjuk végre, hogy a komplementer bázisok közötti 94 és 98 ⁰ C közötti hidrogénkötéseket megtörik. Ezután a templát DNS egy szálát kitakarjuk a láncindítókhoz. Egy pár primert (előre és hátra) kell biztosítani, és hőállóaknak kell lenniük ahhoz, hogy elviseljék a magas hőmérsékletet. A primerek egyenes szálú rövid DNS-szekvenciák, amelyek komplementerek a cél DNS-fragmens végeivel. A szintetikus primereket PCR-ben használják. Az alapozók a minta DNS komplementer bázisaihoz kötődnek és egy új szál szintézisét kezdeményezik. Ezt a lépést egy Taq polimeráz enzim katalizálja; a Thermus auqaticus izolált termostabil DNS polimeráz enzim. Amikor primerek és nukleotidok (építőelemek) állnak rendelkezésre, a Taq polimeráz a templát DNS-hez komplementer DNS új szálát konstruálja.A PCR program végén az amplifikált DNS-fragmenst gélelektroforézissel figyeljük meg. Ha további elemzésre van szükség, a PCR-terméket a gélből megtisztítjuk.

A PCR nagyon hasznos a genetikai és a szerzett betegségek diagnosztizálásához és megfigyeléséhez, a bűnözők azonosításához (az igazságszolgáltatás területén), a DNS célzott szegmensének felépítésével és működésével, a szervezet genomjainak szekvenálásával és leképezésével stb. A PCR rutin laboratóriumi technikává vált a tudósok orvosi és molekuláris biológiai kutatólaboratóriumaiban, mivel széles körű alkalmazásokkal rendelkezik.

2. ábra: Polimeráz láncreakció

Mi a különbség a gén klónozás és a PCR között?

- Gene-klónozás vs PCR

A gén-klónozás egy specifikus gén
in vivo többszörös másolatának előállítása rekombináns DNS-en keresztül és gazdasejt-baktérium. A PCR-technika PCR-reakciók ismételt ciklusai révén többszöröse egy	in vitro DNS-szekvencia több példányát. A rekombináns DNS konstrukciójának követelménye
A gén megtalálása céljából rekombináns DNS-t állítanak elő.
A rekombináns DNS-t nem állítják elő.	Munkafogyasztás
Ez a folyamat munkaigényes.
Intenzív munkaerőre nincs szükség.	In vivo vagy In vitro eljárás
A rekombináns DNS kialakítása
in vitro és a DNS amplifikációja in vivo. A DNS amplifikációja teljesen	in vitro történik. Összefoglaló - Gene-klónozás vs PCR

A DNS-amplifikációhoz két módszer alkalmazható a génklónozás és a PCR-k esetében. A PCR egy

in vitro eljárás, amely egy adott DNS-fragmens DNS-többszörözését teszi lehetővé rekombináns DNS és gazdaszervezet nélkül. A génklónozás leginkább egy in vivo folyamat, amely a gazdaszervezeten belül egy érdekelt gén több példányát eredményezi rekombináns DNS-konstrukció útján. Ez a különbség a Gene-klónozás és a PCR között. Referencia:

1. Griffiths, Anthony JF. "Egy adott gén klónozása. "Modern genetikai elemzés. U. S. National Library of Medicine, 1999. január 01. Web. 201. február 22.

2. "Polimeráz láncreakció (PCR). "Nemzeti Biotechnológiai Központ Információ. U. S. National Medicine Library, n. d. Web. 201. február 22.

Kép jóvoltából:

1. "17 01 06 ábra" CNX OpenStax - (CC BY 4. 0) Commons Wikimedia alatt

2. "PCR" Madprime által - Saját munkák (CC BY-SA 3. 0) Commons Wikimedia alatt