A különbség a Sanger szekvenálás és a piroszkopálás között | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Legfontosabb különbség - Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
a DNS-szekvenálás nagyon fontos DNS-elemzés, hiszen a tudás a megfelelő nukleotid-elrendezés egy adott DNS-régióban számos fontos információt tár fel. Vannak különböző DNS-szekvenálási módszerek. A Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing két különböző DNS-szekvenáló módszer, amelyeket széles körben alkalmaznak a Molecular Biology. A legfontosabb különbség a Sanger-féle szekvenálással és Pyrosequencing, hogy Sanger-féle szekvenálással használ didezoxinukleotidok, hogy megszünteti a DNS szintézist olvasni a nukleotid szekvencia, míg Pyrosequencing érzékeli a pirofoszfát kiadás beépítésével a nukleotidok és szintetizáljuk a komplementer szekvencia pontos leolvasásához sorrendben a sorrend.
Tartalomjegyzék
1. Áttekintés és kulcskülönbség
2. Mi a Sanger Sequencing
3. Mi a Pyrosequencing
4. Side by Side Összehasonlítás - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Összegzés
Mi a Sanger szekvenálás?
Sanger szekvenálás egy első generációs DNS-szekvenálás által kifejlesztett módszer Frederick Sanger és a főiskolák 1977-ben is ismert láncterminációs szekvenálás vagy didezoxi szekvenálás , mivel ez alapján lánc terminálás dideoxinukleotidokkal (ddNTP-k). Ezt a módszert széles körben használták több mint 30 éven át, amíg az új generációs szekvenciát (NGS) kifejlesztették. A Sanger szekvenálási technika lehetővé tette a helyes nukleotidrend felfedezését vagy egy adott DNS-fragmens csatolását. A DNS-szekvenciák szelektív beépítésén alapul és a DNS-szintézis megszüntetésén alapul in vitro DNS-replikáció során. A 3 'OH csoportok hiánya a foszfo-diészter kötés kialakulásának folytatása érdekében a szomszédos nukleotidok között a ddNTP-k egyedi jellemzője. Ezért, miután a ddNTP csatlakoztatva lett, a lánchosszabbítás megszűnik és ebből a pontból megszűnik. Négy ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP és ddTTP - a Sanger szekvenálás során használatos. Ezek a nukleotidok leállítják a DNS-replikációs folyamatot, amikor beépülnek a DNS növekedési szálába, és változó hosszúságú rövid DNS-eket eredményeznek. Kapilláris gélelektroforézist használnak arra, hogy ezeket a rövid DNS-szálakat méretük szerint egy gélen rendezzék, amint azt a 01. ábra mutatja.
1. ábra: A szintetizált rövid DNS kapilláris gélelektroforézise
A
in vitro DNS replikációjához kevés követelményt kell biztosítani. Ezek a DNS-polimeráz enzim, a templát DNS, az oligonukleotid primerek és a deoxinukleotidok (dNTP-k). A Sanger szekvenálásánál a DNS-replikációt négy különálló kémcsőben hajtjuk végre négy különféle ddNTP típus mellett. A deoxinukleotidokat nem teljesen helyettesítik a megfelelő ddNTP-k. Az adott dNTP (például dATP + ddATP) keverékét a csőbe visszük be és replikáljuk. Négy különálló csőterméket négy külön kútban gélen futtatnak. Ezután a gél olvasásával a szekvenciát a 02. ábrán bemutatott módon állíthatjuk elő.
A Sanger szekvenálás fontos technika, amely segít a molekuláris biológia számos területén. Az emberi genomprojekt sikeresen megvalósult Sanger szekvenálás alapú módszerekkel. Sanger-féle szekvenálással is hasznos cél-DNS-szekvenálás, a rák és a genetikai betegség kutatási, génexpressziós analízist, Human, kórokozó kimutatására, mikrobiális szekvenálás stb
Számos hátrányai Sanger szekvenálás:
A hossza a DNS lény a szekvenciák nem haladhatják meg az 1000 bázispárt
- Egyetlen szálat egyszerre lehet szekvenálni.
- A folyamat időigényes és drága.
- Ezért új, fejlett szekvenálási technikákat fejlesztettek ki idővel a problémák leküzdésére. Azonban a Sanger szekvenálás még mindig használatban van, mivel rendkívül pontos eredményei akár 850 bázispár hosszúságú töredékekig.
Mi a Pyrosequencing?
A piroszkopálás egy új DNS-szekvenálási technika, amely a "szekvenálás szintézissel" alapul. Ez a technika a pirofoszfát felszabadulásának kimutatására támaszkodik a nukleotid beépüléskor. Az eljárást négy különböző enzim felhasználja: DNS polimerek, ATP-szulfuriláz, luciferáz és apiráz és két szubsztrát adenozin-5'-foszfoszulfát (APS) és luciferin.
Az eljárás a primer kötődésével kezdődik az egyszálú DNS-templáttal, és a DNS-polimeráz elindítja a komplementer nukleotidok beépülését. Amikor a nukleotidok összekapcsolódnak (nukleinsav polimerizáció), akkor felszabadítja a pirofoszfátot (két foszfátcsoportot összekapcsolják) és energiát. Minden nukleotid addíciója felszabadítja a pirofoszfát ekvimoláris mennyiségét. A pirofoszfát ATP-szulfurilázzal ATP szubsztrát jelenlétében átalakul ATP-vé. A generált ATP meghajtja a Luciferin luciferáz által közvetített átalakulását oxi-luciferinné, és így látható fényt állít elő olyan mennyiségekben, amelyek arányosak az ATP mennyiségével. A fényt fotonérzékelő eszköz vagy fotomultiplikátor érzékeli, és létrehoz egy programot. Az apiráz a reakcióelegyben lebontja az ATP-t és a nem beépített dNTP-ket. A dNTP hozzáadása egyszer egyszerre történik meg. Mivel a nukleotid hozzáadása a fény beépítésével és kimutatásával ismert, a templát szekvenciája meghatározható.A pirogént a minta DNS nukleotidszekvenciájának előállítására használjuk, a 03. ábrán bemutatva.
A piroszcnálás nagyon fontos a nukleotid polimorfizmusának analízisében és a rövid DNS szakaszok szekvenálásában. A nagy pontosság, a rugalmasság, az egyszerű automatizálás és a párhuzamos feldolgozás előnye a piros szekvenálásnak a Sanger szekvenálási technikákkal szemben.
03. ábra: Pyrosequencing
Mi a különbség a Sanger Sequencing és Pyrosequencing között?
A diffúziós szekvenálás egy DNS-szekvenálási módszer, amely a ddNTP-k DNS-polimerázzal és láncterminációval történő szelektív beépítésén alapul.
Pyrosequencing egy DNS-szekvenálási módszer, amely a nukleotid beépülésén alapuló pirofoszfát felszabadulása alapján történik.
ddNTP |
|
| ddNTP-ek használata a DNS-replikáció megszüntetésére | ddNTP-k nem használatosak. |
| Enzimek bevonásával | |
| DNS polimeráz alkalmazható. | Négy enzim alkalmazható: DNS polimeráz, ATP-szulfuriláz, Luciferáz és Apyráz. |
| Használt aljzatok | |
| APS és Luciferin nem használatos. | Adenozin-5'-foszfoszulfátot (APS) és luciferint használunk. |
| Maximum Temperature | |
| Ez egy lassú folyamat. | Ez egy gyors folyamat. |
| Összegzés - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing | |
| A Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing két olyan DNS-szekvenáló módszer, amelyet a molekuláris biológiában használnak. A Sanger szekvenálás a nukleotidok sorrendjét konstruálja a lánchosszabbítás megszüntetésével, míg a piroszekvencia a nukleotidok pontos sorrendjét konstruálja nukleotidok beépítésével és a pirofoszfátok felszabadulásának kimutatásával. Ezért a fő különbség a Sanger-szekvenálás és a Pyrosequencing között az, hogy a Sanger-szekvenálás a lánchosszúság szekvenálásán dolgozik, miközben a piroszekvenálás szintézissel történik. | Referencia: |
1. Fakruddin, Md és Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-egy alternatíva a hagyományos Sanger szekvenáláshoz. "American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Tudományos publikációk, 2012. március 02. Web. 2017. február 28.
2. "Sanger szekvenálás. "Sanger szekvenálás - ScienceDirect téma. N. p., n. d. Web. 201. február 28.
Kép jóvoltából:
1. "Didesoxy-Methode" Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, a Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) Commons Wikimedia alatt
2. "Sanger-DNA-seq" Az Enzo a lengyel nyelvű Wikipedia-ban (CC BY-SA 3. 0) Commons Wikimedia alatt
3. "Pyrosequencing" microbiologybytes (CC BY-SA 2. 0) Flickr
